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Chinese Translation Vol 11, Issue 3

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美国《Emerging Infectious Diseases2005年第3期有关人兽共患病论文摘译

P361 弯曲菌属的苍蝇传播// Gordon L. Nichols

英格兰和威尔士一年一度的弯曲菌感染增长期开始于五月份,到六月上旬达到了顶峰。这种发病趋势见于各个年龄组和所有地区。对危险因素的 调查发现,苍蝇是解释这种季节性消长发病趋势的重要传染源。对感染模型的观察推测,每年空肠弯曲菌流行的原因,可能是由于污染了粪便的苍蝇所携带的致病物 质造成人类的直接或间接感染所致。一个地区人类空肠弯曲菌病的发生是随机的,然而,该病流行的地区性和时间特征却与某种或某些苍蝇的生活周期有关。这一推 测可解释全球空肠弯曲菌感染的季节性分布特点。

图1 1989-2002年英格兰和威尔士弯曲菌感染病例百分比图。

分析历年全国各城镇实验室每天上报的弯曲菌感染病例占该年全部病例总数的百分比表明,全国每年弯曲菌感染趋势存在极为相似的变化。

图2 每周弯曲菌感染病例和家蝇生活周期的关系图。

图中各方块代表每周弯曲菌感染病例数量。该图的结果表明,家蝇生活周期越短,弯曲菌感染病例越多。

P385 埃博拉病毒广泛存在于高危的人群和狗中// Loïs AllelaOlivier BourryRégis Pouillot,等

在2001~2002年加蓬地区埃博拉病毒爆发流行期间,我们观察了一些因食用感染动物尸体而高度接触埃博拉病毒的狗。为了检测这些动 物是否被病毒感染,我们抽样了439条狗,并运用埃博拉病毒特异免疫球蛋白(IgG)试验、抗原检测和病毒多聚酶链反应扩增的方法对其进行筛选:来自2个 主要城市的79例样本中有2例(8.9%)、来自Mekambo的99例样本中有15例(15.2%)、来自埃博拉病毒流行地带村庄中159例样本中有 40例(25.2%)检测到了埃博拉病毒IgG,而作为对照的来自法国的102例样本中只有2(2%)例检测到该类似物。在同时有动物尸体感染和人类感染 病例的村庄的狗当中,血清阳性率高达31.8%, 血清阳性率与离埃博拉病毒流行地带的距离呈显著的正相关。本研究表明,狗能被埃博拉病毒感染,且推测感染并无症状。

P449 肺炎患者中的Mimivirus// Bernard La ScolaThomas J. MarrieJean-Pierre Auffrayand Didier Raoult

Mimivirus是一类阿米巴样军团菌,为迄今所知最大的病毒。以Mimivirus为抗原进行游走抑制因子试验发现,社区获得性和医院获得性肺炎患者都可呈现出血清转化现象。医院获得性肺炎患者的呼吸道标本中可以检测到Mimivirus DNA。

P489 保存污泥标本中的Noroviruses// Sylvain SkraberRonald ItaliaanderWillemijn J. Lodder and Ana Maria de Roda Husman

运用当前技术对保存的污泥标本(收集自1987年)进行病原学检测发现了norovirus GGII6 Seacroft的特征,回顾性研究有助于进一步了解这类水源性传播的新现病原体。Norovirus,曾被归入诺沃克病毒,是一类肠道病毒,可引起胃肠 炎的爆发流行。除了人与人之间的传播外,这类病毒还能通过水源传播。该病毒无法经细胞培养传代,用免疫方法和电子显微镜技术检测费时耗力,最好的检测方法 是运用分子生物学技术。该病毒极易发生变异,新变异株可取代原先的流行株成为优势病毒株,原先的流行株可能逐渐消失。

P373 冠状病毒检测新方法及其在其他病原体检测中的应用前景//Rangarajan Sampath,Steven A. Hofstadler,Lawrence B. Blyn,

冠状病毒与人和动物的许多疾病有关。迄今至少已发现了13个种属多个抗原表型的冠状病毒,其中人冠状病毒包括HCoV-OC43和 HCoV-229E两个抗原型,是引起人类上呼吸道感染的重要病原体。2003年严重急性呼吸系统综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)在中国和世界上其他国家爆发流行,其病原体SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)作为新的病毒亚种引起了社会的广泛关注。如何快速准确地鉴 定SARS-CoV已成为目前亟待解决的难题。

当前,对于感染性疾病病原体的检测,主要是基于PCR扩增方法,这需要预知核苷酸序列信息,设计特异的引物,对于新现病原体或当前基因 序列不明的病原体,在很大程度上仍然有赖于传统的培养方法和显微镜技术观测。联合运用广谱聚合酶链式反应(Broad-range Polymerase Chain Reaction,BR-PCR)和电喷雾离子化傅立叶转换离子回旋共振质谱法(Electrospray Ionization Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry,ESI-FTICR-MS)大量扩增病原体并对扩增产物作碱基组成分析,能够准确鉴定病原体,可以弥补传统方法费时耗力且敏感 度不高的缺陷,为新现病原体的快速检测提供新的途径。本文介绍Sampath R等发展的联用BR-PCR和ESI-FTICR-MS技术检测和鉴别多种冠状病毒,并对该类方法在其他类型病原体检测中的应用作一评价。

1. 广谱PCR扩增冠状病毒
1.1 冠状病毒分离株和引物的设计

14株冠状病毒分离株来自9个不同的冠状病毒种属。其中5株为与人类感染有关的HCoV 229E(2株),HCoV OC43以及新现病原体SARS-CoV(2株);其余9株为与动物感染有关的冠状病毒。

对所有GenBank中冠状病毒基因组序列进行分析,确定RNA依赖的RNA多聚酶(RdRp)区域和Nsp14区域的保守性。选取SARS TOR2基因组的RdRp和Nsp14区域设计两对引物(RdRp引物和Nsp引物),并在引物的高度保守位点插入5’丙炔基修饰的胞嘧

啶或胸腺嘧啶核苷酸(见表1),这样只需要很少的同源区便可启动扩增,从而从最大范围

的病原体中扩增出产物。

1.2 RNA抽提,逆转录和PCR反应

用Trizol或Trizol LS试剂盒从250uL感染了冠状病毒的细胞或注入了3ug PolyA DNA的培养液上清中提取RNA。RNA纯化后取10ul加入到5uL含500ng随机引物的DEPC水中,再加入1ug PolyA DNA和10u SUPERaseIn,混合液60℃反应5分钟,冷却至4℃。引物和RNA退火,引物混合物中加入2x第一链buffer、10mmol/L DTT、500umol/L dNTP以及7.5U的SuperScriptII组成20uL第一链反应混合物,在45℃反应45分钟便可得到逆转录反应产物。

所有的PCR反应在96孔微孔板和M.J.Dyad热循环仪中进行。50uL反应体系中含4U Amplitaq Gold,1x buffer II, 2.0 mmol/L MgCl2, 0.4mol/L betaine, 800umol/L dNTP 混合物和250nmol/L引物,模板为各种稀释度的逆转录反应产物。扩增条件:95℃ 预变性10分钟,然后95℃ 30s,50℃ 30s,72℃ 30s 进行扩增,50个循环后结束反应。

2. 质谱分析和信号处理

用Bruker Daltonics Apex II 70e ESI-FTICR-MS 对BR-PCR 扩增产物进行分析。产物脱去盐分,加入作为内分子量标准的寡核苷酸片段SH2(CGTGCATGGCGG),使其终浓度为50nmol/L,混合物进行电 喷雾离子化,将DNA分子分离成有意义链和反义链,依据特定质量/电荷比值对各条链进行分析并汇集成质谱(见图1)。

将采集到的扩增产物的质谱数据输入到信号处理机,用ICR-2LS软件包分析,计算出各条链的分子量,经算法处理后最终获取碱基组成数 据,通过数据库检索,可以得到各条链准确的碱基序列。用内分子量标准对质量/电荷比值进行校正,通过质量/电荷比值获取检测到的核苷酸分子数,从而可以计 算出各样本中生物体的同一性和多样性。

3.检测的结果

14株冠状病毒分离株的扩增产物经质谱分析结果显示,同一种属病毒的扩增产物分子量相似,其RdRp区域碱基组成完全一致,而Nsp14 区域碱基组成基本相同。扩增产物经测序分析获取的碱基序列与该冠状病毒在GenBank中相应区域的序列相符。在GenBank中无基因组序列记录的冠状病毒,其测序的结果与质谱得到的结果也能吻合。

用RdRp引物对同一管内的3种人冠状病毒进行PCR扩增,获得了预期片段,质谱可检测并辨别所有3种病毒扩增产物的信号,这些信号与对单个病毒进行检测时所获得的信号相对应。对3种人冠状病毒(HCoV 229E,HCoV OC43 和SARS-CoV)RdRp区域的碱基组成进行比较发现,HCoV 229E需要净增加2个腺嘌呤核苷酸,3个胞嘧啶核苷酸,净减少5个鸟嘌呤核苷酸,才能被误判为SARS-CoV,而这种净改变发生的概率很小,Δm为8.8;HCoV OC43被误判为SARS-CoV的概率也很小。

实验检测结果表明,根据保守区域设计引物,用广谱PCR的方法可以扩增大量病原体,各病原体保守区域的碱基序列存在细微差异,利用 ESI-FTICR-MS分析扩增产物的碱基组成,可以准确鉴定病原体。由于无需预先知道病原体的详细序列信息,利用该法可以发现病原体的新亚种。对所有 14种冠状病毒分离株在种系发育树上的分布进行分析,计算各分离株保守区域碱基突变离散率表明,SARS-CoV属于冠状病毒的一个新的亚群,而非最初认 为的属于冠状病毒第2亚群(见图2),由此推断,SARS-CoV附近还存在许多该新亚群成员,而BR-PCR和ESI-FTICR-MS的联合使用,将 是发现这些新成员最有力的工具。

4.评价

本文所介绍的结合BR-PCR和ESI-FTICR-MS对病原体进行扩增并作碱基组成分析的方法,可以快速鉴定某一已知病毒家族新病 毒亚种。BR-PCR具有从大量生物体中扩增出产物的能力,每个PCR反应的信息含量非常高,可以对扩增产物作进一步测序分析,也可以设计种属特异性引物 对PCR产物继续扩增,这有助于病原体亚种属水平的分类。ESI-FTICR-MS分辨率极高,能准确地检测出核苷酸片段的碱基组成,它由一个自动的微量 滴定板模式控制,具有强大的分析复杂PCR产物的能力,每天每台仪器可以分析900个以上的PCR反应产物,可以从根本上解决BR-PCR扩增产物分析费 时耗力的缺点。

联合运用BR-PCR和ESI-FTICR-MS除了可以快速、敏感、高通量地检测冠状病毒,还可以延伸到检测其他病毒、细菌、真菌和 原虫类病原体。BR-PCR是否能成功扩增出产物是能否检测到病原体的关键所在;而电喷雾离子化过程中保持DNA分子的完整性,对于准确鉴定病原体相当重 要。解决这些问题对这类方法在病原体检测领域能否获得广泛应用起着决定性作用。

表1 PCR引物对

Primer name

Gene name

Product name

Genome coordinates

Orientation

Product length (bp)

Sequence (5´ to >3´)

RdRp primer

ORF 1b

Nsp12-pp1ab (RdRp)

15146-5164

Sense

88

TAAGTTTTATGGCGGCTGG

15213-5233

Antisense

TTTAGGATAGTCCCAACCCAT

Nsp14 primer

ORF 1b

Nsp14-pp1ab (nuclease ExoN homolog)

19113-9138

Sense

137

TGTTTGTTTTGGAATTGTAATGTTGA

19225-9249

Antisense

TGGAATGCATGCTTATTAACATACA

所有的引物根据SARS TOR2 基因组(GenBank 编号NC_004718.3)设计。

图中显示的加粗的字母为5’丙炔基修饰的嘧啶核苷酸。

RdRp为RNA依赖的RNA多聚酶。

图1 电喷雾离子化傅立叶转换离子回旋共振质谱法图示。

SARS-CoV用5’丙炔基修饰的RdRp引物进行PCR扩增,扩增产物经电喷雾离子化分离成有意义链和反义链,从显示的水平轴 m/z范围内可观察到多个电荷分布状态。插图为(M-27H+)27-病毒种属同位素标记的两条链的放大视野。扩增子两条链派生的分子质量为 27298.518(+0.03)Da和27125.542(+0.03)Da,与扩增子双链A27G19C14T28/A28G14C19T27的碱基 组成相对应,这也是SARS分离株预期的碱基组成。

图4 冠状病毒分离株在种系发育树上的分布图。

根据冠状病毒两个保守区域碱基突变离散率,获得14株冠状病毒在种系发育树上的相对位置。每个椭圆代表了它所含有的该群成员的集合,椭圆旁边的数字表示同一群中各成员之间的突变离散率。

(福建医科大学病原生物学系 王芝敏编译 郑铃审校)

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