德国的传入性Lassa热: 一种新的Lassa病毒的分子学性状

Stephan Günther, Petra Emmerich, Thomas Laue, Olaf Kühle, Marcel Asper, Annegret Jung, Thomas Grewing, Jan ter Meulen, and Herbert Schmitz
Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, Hamburg, Germany

Chinese Translations - 中文译本 > Volume 6 - 第6卷

Article in English

本文叙述了对德国一株新传入的Lassa病毒的分离和鉴定。该病毒是由一名游历过Ghana,Cote D’lvore和Burkina Faso后，又到德国访问的旅行者所带入，被名为“ＡＶ"的这种病毒起源于西非的一个地区，而在该地，Lassa热从未见有过报导。从病人血清中分离的S RNA被扩增和测序。大跨度逆转录聚合酶链反应能够将病毒S RNA进行全链扩增。该ＡＶ病毒株的编码序列与已知的Lassa病毒原型株(Josiah,Nigeria,and LP)有约２０％的差异，且该差异主要集中在第三密码子的位置。进行系统树分析表明，该株AV病毒与来自Sierra Leone的Josiah 株关系最近。Lassa病毒包括一大类基因型各异的病毒系，这对于疫苗的开发有一定的指导作用。文中新建立的S RNA全链扩增的方法能够有助于新的砂粒病毒或砂粒病毒系进行鉴定和分子生物学的分析。

Lassa病毒从其天然的啮齿类动物宿主传播向人类后，能引起出血热，这是种具有高死亡率的临床综合症。在西非，Lassa热是一种地方性疾病，，在Sierra Leone,Guinea,Liberia和Nigeria曾有报导。由于这种病毒的啮齿类动物宿主(Mastomys species)在亚撒哈拉非洲的绝大部分地区都相当普遍，它的局域性爆发并未得到很好的认识。Lassa病 毒极少通过比如旅行者的途径向其它地区传入，文献中也只有很少报导。尽管传入性疾病会引起公众的关注，主要因为它具有人与人之间传播的可能性，高致病性的 病毒特性，以及缺乏有效的安全的治疗等特点。但实际上，仅从一个传入性疾病的病例而引起感染的危险性是很低的，况且，在病人及相关人员中已印发了大量的手 册来指导对该病的处理。

经过种系发育史，血清学及地理学上的分析，砂粒病毒可被分为两个主要的大群，旧世界群(比如Lassa病毒,lymphocytic choriomeningitis病毒[LCMV])和新世界群(比如Tacaribe病毒,Junin病毒,Machupo病毒). Lassa病毒的各分离株在基因型血清学及致病的特点上都有所不同，这种变化由分离自不同发源地的Lassa 病毒株之间很少见到交叉补充固定和交叉平衡得到证明。血清学上的不同可通过用病毒特异性的特异性与病毒分离株进行方阵凝集来证实。

单链的砂粒病毒基因由一段小的RNA片断(S)和一段大的RNA片断(L)组成大小分别为3.4ＫＢ和７ＫＢ。S RNA编码病毒的糖蛋白前体蛋白(GPC)和核蛋白(NP),L RNA编码病毒的聚合酶和一个小的有锌键合的蛋白(Z)。对分别来自Sierra Leone(Josiah株)和Nigeria (Nigeria株)的两病毒株的完整S RNA和附加株的短链S RNA片断进行测序，结果表明它们之间的基因型有相当大的差异。由于技术上的问题，对大量的分离株进行S RNA全链序列分析是很复杂的。这些问题比如：在细胞培养中要生产足够量的病毒以用于直接克隆，及病毒S RNA中保守区域的存在限制了聚合酶链反应(PCR)的引物。

本文我们报导将一种新的病毒带入德国的旅行者身上进行的该病毒的分离和基因序列特点。这种新的病毒源自西非从未有过Lassa热报导的地方。为了有助于新病毒分离株的分子生物学分析，我们建立了大跨度的(RT)-PCR方法。设计的引物结合在RNA保守性末端，从而能够对直接从血清中分离的整链S RNA进行扩增。

方法

患者介绍

该病毒携带者为一２３岁的德国女性，在旅行三个西非国家之后（如图1），开始发烧并出现<flulike>综合症，在Abidjan,Cote D’Ivoire，她曾拜访过的Cocody大学中心医院门诊部，在那里被诊断为疟疾。发病后的第６天，她回到德国并住进了在Schwabisch Hall的Diakonie医院，在做出疟疾和细菌感染的诊断之后，在发病的第９天，被转到位于<Wurzburg>的Missionsarztliche的热带疾病部。在那里，她被诊断出发烧，咽炎，腹汇，和胸腔积水，怀疑是Lassa热感染，并将血清送到汉堡的Bernhard-Nocht-Institut研究所。经过PCR和病毒分离，她被确诊为Lassa病毒感染。尽管采取了紧急的<ribavirin>处理和加强治疗，患者的临床症状还是不断恶化，并于发病后的第１４天死于出血，器官衰竭和脑病。

用免疫荧光法和免疫印迹法进行的病毒分离和检测。

在４级生物安全条件下，分别向生长于10ml Leibowitz培养基中的vero细胞中加入患者血清各1ml, 0.1ml, 0.01ml, 0.001ml，然后每天观察细胞形态学改变，并用免疫荧光法检查细胞培养基的感染情况。细胞收获后，将其涂于免疫荧光平板上，自然干燥后用丙硐固定。然后用 稀释至1：50的Lassa病毒核蛋白特异性单克隆抗体L2F1和稀释至1：60的异硫氰荧光素标记的抗鼠免疫球蛋白(Ig)Ｇ(Dianova,Hamburg,Germany)来进行检测。

至于免疫印迹分析法，细胞收获后进行离心沉淀。然后在缓冲溶液中将沉淀用SDS进行细胞裂解，并煮沸5分钟。所有的裂解物经含15% SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再将蛋白质转移至硝酸纤维膜上(Schleicher&Schuell,Germany)。Lassa病毒的Z蛋白就可以用鸡抗Z血清抗体(稀释至 1:5000)和作为第二抗体的过氧化酶标记的抗鸡IgY(稀释至 1:2000)(Dianova)通过化学发光来检测。

SRNA的RT-PCR

按照说明书，用QIAamp Viral RNA kit试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)分别从140ul患者血清或Lassa病毒感染的细胞培养基上清液和LCMV感染的VERO细胞和L细胞中将病毒RNA提取出来(RNA的洗脱用50ul缓冲液)在SRNA整链逆转录中，将纯化的RNA(3-6 ul)与20pmol逆转录引物(CGCACCGDGGATCCTAGGC)在8ul的微量管中70℃共同孵育15分钟，然后将混合物于冰中迅速冷却并离心。将19ul反应预混合料(含8ul混合RNA引物，50Mm PH8.3的Tris-HCl，75mM KCl,3mM MgCl2, 10Mm DTT,500uM dNTP)50℃孵育２分钟，加入200单位(1ul)Ⅱ号逆转录酶(Life Technologies,Karlsruhe,Germany)和一滴矿物油。该反应进行的温度流程如下：50℃30分钟,55℃5分钟,50℃20分钟,60℃1,50℃10分钟,然后70℃保持15分钟以失活酶,再加入2单位(1ul)的RNA裂解酶H(Life Technologies)并于37℃孵育20分钟消除RNA。从整链SRNA逆转录得到的cDNA用Expand High Fidelity PCR System系统(RocheMolecularBiochemicals,Mannheim,Germany)以热起始进行扩增，一份45ul的反应预混合料包括：1ulcDNA,含1.5mM MgCl2的1x缓冲液，200uM dNTP,和PCR1到PCR4不同引物混合物(PCR1,tatggcgcgcCGCACCGDGGATCCTAGGC;PCR2,tatggcgcgc CGCACCGAGGATCCTAGGCAT,PCR3,tatggcgcgc CGCACCGGGGATCCTAGGCAAT; PCR4, tatggcgcgcCGCACCGGGGATCCTAGGCTT; PCR5, tatggcgcgcCGCACCGDGGATCCTAGGCWWT;有助于克隆的低水平下经AscI处理的异源性序列)上覆两滴油并加热到55℃。然后，加入5ul酶混合物(含1.5mM MgCl₂的1x反应缓冲液中加入2.6单位的Taq和Ｐwo聚合酶而成)，PCR反应进行40个循环，其中94℃1分钟，55℃1.5分钟，72℃3分钟，并且在Robocycler(Stratagene,La Jolla,California)中每10个循环后增加2分钟的延伸时间。

在单独的PCR中，SRNA的一个340-bp大小的片断能够用Superscript One-Step RT-PCR(Life technologies)和引物36E2(ACCGGGGATCCTAGGCATTT)和80F2(ATATAATGATGACTGTTGTTCTTTGTGCA)其方法如上所述。

序列测定

ＰＣＲ扩增产物经ＱIaquick PCR purification kit试剂盒(Qiagen)纯化后可直接用BigDye Terminator AmpliTaq kit试剂盒(Applied Biosystems,Weiterstadt,Germany)测序。延伸产物在ABI 377自动测序仪上（Applied Biosystems）可被分离。用引物36E2和80F2可对340-bp片断进行测序。独立逆转录PCR的SRNA整链扩增产物收集后，其正负链可用下列引物进行测序(数字表明引物的5`端核苷酸在Lassa病毒Josiah株的SRNA基因序列中的位置;引物 LV-SJ和LV-S分别从Josiah株和AV株中得到): LV-S^J1-plus(GCACCGGGGATCCTAGGCATTTTTGGTTGC); LV-S^J359-plus(GGACTAGAACTGACCTGACCAACAC);LV-S^AV834-plus (GCACATTCACGTGGACACTGTCAGA);LV-S^AV1032-plus (TGAAATCTGAAGCACAAATGAGCAT);LV-S^AV1833-plus (GTGATTCAAGAAGCTTCTTTATGTC);LV-S^AV2372-plus (AGATTTTGTAGAGTATGTTTCATA); LV-S^J2937-plus(TGCACTTAATGGCCTTTCTGTTCT); LV-S^AV479-minus(GGTGGAAAGTTGAGATTATGCTCAT);LV-S^J991-minus (CATGTCACAAAATTCCTCATCATG);LV-S^AV1906-minus (ACATAAAGAAGCTTCTTGAATCACA);LV-S^AV1955-minus (ATTGAGGCGCTCCCCCGGAATATGG);LV-S^J2618-minus (CTAAATATGATTGACACCAAGAAAAG);LV-S^J3902-minus (AATCAAGCGGTCAACAATCTTGTTGA);LV-S^J3402-minus (CGCACAGTGGATCCTAGGCTATTGGATTGC)每个核苷酸的位置都被至少两个不同的引物进行测序。其重迭的序列是同一的，而且没有观察到模糊序列。

系统进化分析

系统树分析是基于核蛋白的基因片断进行的，因为在Lassa病毒Josiah株SRNA中1724~2349的位置包含了砂粒病毒基因序列数据中的最大数据组。核蛋白基因序列已经被测定的病毒有Lassa病毒AV株以及下列病毒株(表示方式为：病毒，基因库／EMB的序列号):Tacaribe,M20304;Ippy,U80003;Mopeia AN20410,U80005;Mopeia AN21366,m33879;Mobala3076,AF012530; Mobala3051,U80006; Mobala3099,U80007; Lassa LP,U80004; Lassa Nigeria,X52400; Lassa Josiah,J04324;LCMV Armstrong,M20869; LCMV WE,M22138;和 LCMV MaTuMX,Y16308。其中Lassa病毒Josiah株，Nigeria株，AV株和Mopeia病毒AN21366株的核蛋白和糖蛋白前体蛋白基因序列都已作全链分析，系统树分析采用PHYLIP分析系统(3.75版)。每分枝带作为一个单独的变异株。用DNADIST和NEIGHBOR来进行株间遗传学距离的计算和相邻株间关系(NJ)的分析，用DNAML程序来进行最大可能性(ML)的分析。所有分析都在bootstrapped dataset (100 个复制物)以默认设置进行。

结果

新Lassa病毒株起源和分离

该病毒株确切的发源地以及传播的方式和日期都不确定。因为它的潜伏期可达三周，而在此期间患者曾到过Ghana,Côte D’Ivoire和Burkina Faso（如图1）。因而，该病毒发源地可能为上述西非国家的任一个，而在这些国家都未见有过Lassa热的报导。

病毒在VERO细胞中繁殖。病毒接种后15小时，只有极少量的细胞能存活。而实际上，在接种0.1mL经免疫荧光法检测的患者血清40小时后，培养基中的所有细胞都被感染了。与以前的Lassa病毒分离株不同的是，感染后没有观察到实质上的细胞致病效应。但这个现象具体原因还不清楚，是由于不稳定的技术因素（比如接种剂量或培养时间）造成的，还是说明该病毒株真地具有这样一个生物学特征。用核蛋白特异性单克隆抗体进行的免疫荧光法可显示Lassa病毒核蛋白在胞质中的典型的斑点状形态。用Lassa病毒Z蛋白特异性抗体对AV病毒感染的细胞进行免疫印迹法分析，可对Lassa病毒的分离株进一步进行确定。该AV病毒Z蛋白大小为11KD,与近来在Josiah株感染的细胞中检测到的Z蛋白相似。

用RT-PCR对病毒整链SRNA进行的扩增。

为提高和简化对新Lassa病毒分离株的分子生物学分析，我们提出了一种新的方案，对整链SRNA进行逆转录和PCR扩增。将用于逆转录的RT引物，连接在S和L RNA的基因链和互补链终点上(如图３Ａ)。在所有的砂粒病毒中，基因链的这些终点都是高保守序列。逆转录进行的基础温度为50℃，迅速升至55℃和60℃以分解RNA基因间区域稳定的二级结构。PCR使用Taq和Pwo两种聚合酶的混合酶，其中Pwo聚合酶具有３`-５`的外切核酸酶(校正)活性。这两种酶结合能够高敏感，高保真地对长链模板进行扩增。已经发现下列各引物以及经过测试的引物的联合都可以对Lassa病毒和(或)LCMV整链SRNA进行有效的扩增:PCR1;PCR2;PCR3;PCR2和PCR3; PCR2，PCR3 和PCR4;PCR5(如图3B，数据没有列出)。PCR引物与RT引物大致相同，只是包含了５`端内异源性序列以便对Asc I限制性内切酶处理的扩增产物进行克隆。３`端引物PCR1同RT引物完全相符，但引物PCR2到PCR5在３`端都含有2~3个附加的核苷酸，以在逆转录中减少或阻止对由于错误引发而产生的较短产物的扩增，虽然引物PCR2和PCR3的３`核苷酸对Lassa病毒SRNA的两个端点都不能很好地结合，但每个引物都能独自扩增基因片断的全部序列(数据没有列出))。这个特性可能有助于对那些引物结合位点发生突变的病毒株进行扩增，其原因与具有3`~5`外切核酸酶活性的Pwo聚合酶可能有关，因为它可以降解引物，并修正3`端错误配对。总之，我们发展的这种RT-PCR方案能够对Lassa病毒和LCMV病毒分离株的SRNA进行快速的分子生物学鉴定。因为引物的结合位点具有高保守性，这个方案也可能被应用于其它砂粒病毒。

Lassa病毒AV株SRNA序列的测定及同Josiah株,Nigeria株的比较。

SRNA从患者血清中分离后，用PCR2，PCR3和PCR4的联合引物对其进行两次RT-PCR扩增。两次反应都在3.5-Kb的位置显示出一种主要的产物(如图3C)，这表明在数量上占优势的病毒都含有全链SRNA。在1.5至3.4Kb范围内的一些次要产物可能代表自然产生的RNA，比如在砂粒病毒感染的细胞培养中偶尔可见到的染色体缺失，或在RT-PCR中产生的外源性片断。PCR产物经纯化，收集进行测序。SRNA序列可通过对引物36E2和80F2扩增的340-bp大小的PCR片断的测序进行确定，其重迭的序列是完全相同的。该序列被送往GenBank并确定其序列号为AF246121。

Lassa病毒Josiah株，AV株及Nigeria株SRNA的排序表明,三者之间有相当大的差异(如图４)。而就在基因链及互补链GPC和NP的启动密码子上游，3`端和5`位置分别为25-55和3303-3365非编码区域，核苷酸的改变．缺失和插入的出现频率最高，在这些区域以及GPC终止密码子和RNA茎-环结构的开始部分(位置1532-1540)之间的区域核苷酸都没有被完整的保留下来。与此相对的是，RNA的茎-环结构(位置1545-1586)是具有高保守性的，各株间在茎部没有差异，而在环上也只很少有变异。NP和GPC的编码区域序列在三株之间的差异大约在20%，几乎全部是由核苷酸的改变引起的(如表)。LP株的部分NP编码基因序列与AV株差异达25%。变异几乎分布在除一段短的保守性序列外的整个编码区。这种变异的最突出特点是在第三密码子位置的核苷酸变异最多，可达总变异量的80%。与核苷酸相比，氨基酸的变异量则相当低(5%-9%)(如表)。NP中，核苷酸和氨基酸的变异程度要比GPC略高。GPC氨酸的排序表明，N末端的序列与基内部及B细胞决定簇的附近不同(如图5)；一般认为的GP1/GP2(限制酶)切割点的序列是完全保守性的，比如潜在的N连接糖基化位点。但例外的是AV株中有一附加位点，以及Nigeria株中该位点的位置在272。NP中两个氨基酸变异簇都具有相同的特点，就是在三株病毒中该变异簇的不同位置都有大量的甘氨酸残基(如图5)。在绘制的的NP图谱中，B细胞决定簇是具有保守性的，并且，近来在NP中已鉴定的T细胞决定簇，也只有很少的变异发生。

我们采用部分NP序列对Lassa病毒AV株同已知的旧世界砂粒病毒和其它Lassa病毒株进行系统进化的关系分析。结果表明，AV分离株因与其它Lassa病毒株具有100%的同源性，而共同形成一单独的Lassa病毒群分枝。通过分析全链编码区域，发现AV株与Josiah株间GPC具有65%/61%(NJ/ML分析)同源性，NP基因具有94%/97%(NJ/ML分析)同源性，故该两株定为姊妹关系并单独构成一分枝。

结论

三株Lassa病毒Nigeria,Josiah,和AV完整的SRNA序列现已探明，这三株病毒株的整链SRNA序列及LP株的部分序列之间的差异很大，说明Lassa病毒是一个包含有许多不同基因型的种群。AV株在系统发育上与Josiah株最近，这种变异的最突出特点是在第三密码子的位置具有大量的碱基替换，很大程度的偏差发生在NP和GPC启动密码子上游3`端和5`端非编码区域。而在所有的砂粒病毒中，茎-环之间的区域以及第19核苷酸末端的序列是保守的。在我们的研究中，AV病毒的这些末端的保守性的并没有得到直接的证明，但利用连接在这些位置上的引物进行的有效逆转录和扩增都可说明这些问题。3`端和5`端非编码区域的差异，不包括保守性的末端，可说明，可能它们的功能并不需要依赖特异性的基础序列，也可能这些要素的功能性的改变并没有对Lassa病毒的生命圈造成很大的冲击。这些序列同NP和GPC的转录中5`端的非翻译区域是相对应的。在这些区域的变异，特别是在启动密码子周围被称作KOZAK序列上的变异，很可能影响翻译的起始，进而影响蛋白的表达和病毒的生成。非编码区域的变异最后或许可用来解释各Lassa病毒间致病性的差异，正如其它病毒有此现象一样。相对于3`和5`端的非编码区域，RNA的结构具有高保守性，说明在没有严重影响病毒复制的情况下，这一部分不允许进行修饰。其它砂粒病毒中，只有Nopeia病毒有着同Lassa病毒相同的茎-环序列，这可能是这两株病毒能形成稳定的Reassortant的一个原因。四个病毒株的三个不同发源地(LP株和Nigeria株都起源于Nigeria)，以及在一个地区内传播时病毒的亲缘关系都表明Lassa病毒株在地域上的聚集性。西非几个不同地区的Mastomys种之间的基因型差异都可对亚种特异性的Lassa病毒进行选择，不同的Lassa病毒株也可能在基因型相同的Mastomys中有选择性的进化，并且由于缺乏迁移而造成了地理上的分离。

病毒的高度变异对PCR诊断及引物测序的方法设计都提出了一些问题。由于结合位点的突变，绝大多数以Josiah株和Nigeria株的基因序列为基础设计的测序引物都不能对新的病毒株进行退火。另外，在九个病毒序列基础上设计了用于诊断的引物80F2，其结合位点含有三个突变。因为它们只影响引物的5`端的一半，故在PCR中的应用并没有受到很大的影响，确定了它在诊断中的使用。因为具有高保守的引物结合位点，整链S RNA RT-PCR或许可成为Lassa病毒诊断方法之一，但其缺点是灵敏度稍低。

系统树分析表明，相对于以前的分析来说，旧世界砂粒病毒的 树结构具有较小的差异。在我们的分析中，Mobala病毒和Mopeia病毒具有很近的亲缘关系。以前的研究则认为，Mobala病毒同Lassa病毒的亲缘关系最近。然而在两个研究中，<bootstrap>支持性都很低，并且系统树的结构依赖于第三密码子位置所包含的改变。Lassa病毒Nigeria,Josiah和LP的位置在方式相似的再次研究中也不同，需要进行附加序列的分析以说明Mopeia病毒,Mobala病毒和Lassa病毒之间以及Lassa病毒Nigeria株,Josiah株和LP株之间确切的进化关系。

Lassa病毒的疫苗的开发是研究的一个主要目标。用Lassa病毒NP和GPC表达疫苗病毒对动物接种后可获得保护性免疫，该免疫反应可能由Ｔ细胞介导。然而，在特异性病毒蛋白基础上构建的重组疫苗,是否会对异源性的Lassa病毒产生交叉免疫保护还尚未进行研究。近来，人们已经描绘了几个抗原决定簇图谱，可由人对病毒NP特异的CD4+ T细胞克隆识别，其中绝大数至少在三株病毒(Josiah,Nigeria, 和AV)中的两株中是存在的。相对于抗原决定簇，T细胞的识别位点要多得多，而且都具有部分保护性，这表明在用病毒NP为基础的疫苗免疫后，T细胞可能在一个有效的水平上形成叉反应，并对异源性病毒株产生交叉保护。这种观点可由Lassa病毒GPC为基础的疫苗进行的试验得到支持，它表明这种由CD4+ T细胞介导的交叉免疫保护甚至可以对LCMV病毒起作用。我们除可用新的病毒株蛋白进行体内试验以研究T细胞交叉反应外，还可用新的病毒株对重组免疫的机体进行异源性攻击，以增强我们对Lassa病毒特异性的交叉保护性免疫的认识。

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